羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler®系統(tǒng)）工作原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）是一種結(jié)合PCR擴(kuò)增和熒光檢測(cè)的技術(shù)，能夠?qū)NA或RNA進(jìn)行精確定量。羅氏（Roche）的LightCycler®系列儀器（如LightCycler® 480）采用閉管檢測(cè)方式，通過監(jiān)測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)核酸的實(shí)時(shí)定量分析。其核心工作原理可分為以下幾個(gè)部分：

1. PCR擴(kuò)增與熒光檢測(cè)的結(jié)合

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上引入熒光標(biāo)記探針或染料，使擴(kuò)增過程可以被實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。羅氏LightCycler®系統(tǒng)的主要檢測(cè)方式包括：

(1) 基于熒光探針的檢測(cè)（如TaqMan探針）

• 探針結(jié)構(gòu)：

• 探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)（如FAM）和淬滅基團(tuán)（如TAMRA或BHQ）。

• 探針與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)結(jié)合。

• 工作原理：

• 在PCR延伸階段，Taq DNA酶發(fā)揮5'→3'外切酶活性，切割探針，使報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離。

• 報(bào)告基團(tuán)釋放熒光信號(hào)，其強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量成正比。

(2) 基于DNA結(jié)合染料的檢測(cè)（如SYBR Green）

• 染料特性：SYBR Green可非特異性地結(jié)合雙鏈DNA，并在激發(fā)后發(fā)出熒光。

• 檢測(cè)方式：

• 每輪PCR循環(huán)后，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，反映雙鏈DNA的累積量。

• 需配合熔解曲線分析（Melting Curve Analysis）驗(yàn)證擴(kuò)增特異性。

2. 光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)

羅氏LightCycler®儀器采用多通道熒光檢測(cè)，主要流程如下：

1. 激發(fā)光源：LED或鹵素?zé)籼峁┨囟úㄩL的激發(fā)光（如470nm、530nm等）。

2. 熒光采集：

• 光學(xué)傳感器在每輪PCR循環(huán)后掃描各孔熒光信號(hào)。

• 支持多重檢測(cè)（如FAM、HEX、ROX、Cy5等不同熒光通道）。

3. 信號(hào)處理：

• 軟件記錄熒光強(qiáng)度變化，生成擴(kuò)增曲線（Amplification Plot）。

3. 定量分析原理

(1) 閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）

• Ct值（Threshold Cycle）：熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)。

• 定量依據(jù)：

• 初始模板量越高，Ct值越??；反之，Ct值越大。

• 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法（絕對(duì)定量）或ΔΔCt法（相對(duì)定量）計(jì)算目標(biāo)核酸濃度。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法（絕對(duì)定量）

1. 使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（如質(zhì)粒DNA）進(jìn)行梯度稀釋并擴(kuò)增。

2. 繪制Ct值-log(起始拷貝數(shù))標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 根據(jù)待測(cè)樣本的Ct值，計(jì)算其初始模板量。

(3) 熔解曲線分析（特異性驗(yàn)證）

• 適用情況：使用SYBR Green等非特異性染料時(shí)。

• 原理：

• PCR結(jié)束后，緩慢升溫（如60°C→95°C），使雙鏈DNA解鏈。

• 監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)隨溫度的變化，生成熔解曲線。

• 單一峰表示特異性擴(kuò)增；多峰提示引物二聚體或非特異性產(chǎn)物。

4. 羅氏LightCycler®系統(tǒng)的技術(shù)特點(diǎn)

1. 快速溫控：

• 采用Peltier半導(dǎo)體技術(shù)，升降溫速率可達(dá)4.8°C/秒，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

2. 多重檢測(cè)能力：

• 支持4–6色熒光通道，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)（如病原體分型）。

3. 閉管操作：

• 減少開蓋污染風(fēng)險(xiǎn)，提高檢測(cè)穩(wěn)定性。

5. 應(yīng)用示例

• 病毒載量檢測(cè)（如HIV、HBV）：通過Ct值定量病毒RNA/DNA。

• 基因表達(dá)分析（qRT-PCR）：比較不同樣本中mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

• 突變檢測(cè)：結(jié)合高分辨率熔解曲線（HRM）分析SNP或點(diǎn)突變。

6. 注意事項(xiàng)

• 引物/探針設(shè)計(jì)：需確保特異性，避免交叉反應(yīng)。

• 防污染措施：使用UNG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）降解殘留PCR產(chǎn)物。

• 儀器校準(zhǔn)：定期進(jìn)行光學(xué)校準(zhǔn)和溫度驗(yàn)證，保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

總結(jié)

羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀通過熒光標(biāo)記探針或染料實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增，結(jié)合多通道光學(xué)檢測(cè)和Ct值分析，實(shí)現(xiàn)核酸的精確定量。其核心技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于快速溫控、多重檢測(cè)和閉管操作，適用于臨床診斷、科研及工業(yè)檢測(cè)等領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵在于優(yōu)化反應(yīng)體系、規(guī)范操作流程并定期維護(hù)儀器。