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發(fā)布時間：2025/6/10
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隨著分子生物學(xué)和臨床診斷需求的增長，實時熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因表達分析、病原體檢測、SNP 分型、轉(zhuǎn)基因作物檢測、拷貝數(shù)變異研究等領(lǐng)域。羅氏（Roche）LightCycler 96 系列 qPCR 儀器自面市以來，以其精確的溫控系統(tǒng)、靈活的通量配置及友好的軟件界面，獲得了眾多實驗室的使用認(rèn)可。本文將圍繞 LightCycler 96 的設(shè)計架構(gòu)、性能參數(shù)、光學(xué)檢測系統(tǒng)、軟件功能、典型應(yīng)用場景、日常操作與維護、二手設(shè)備驗收要點以及售后服務(wù)支持等方面進行全面介紹，為科研機構(gòu)、第三方檢測機構(gòu)和臨床實驗室提供參考。
LightCycler 96 儀器由機箱主機、溫控模塊、光學(xué)探測單元、觸控屏控制面板和外部配件（如電源線、通信線）組成。機箱尺寸（約 45 cm × 40 cm × 33 cm）適合常規(guī)實驗臺放置；凈重約 17 kg，可滿足多點移動與固定安裝需求。
主機外殼：防塵金屬材料，內(nèi)部設(shè)有風(fēng)道冷卻系統(tǒng)，維持元器件工作溫度。
溫控模塊：采用半導(dǎo)體 Peltier 器件加熱與制冷，溫度反饋采樣點分布于底板與蓋板，實現(xiàn)多點溫度監(jiān)控。
光學(xué)探測單元：集成 LED 激發(fā)源與光電倍增管（PMT）探測器，通過濾光片組選擇不同熒光通道。
控制面板：7 英寸觸摸屏，嵌入式操作系統(tǒng)即時顯示反應(yīng)進程和曲線圖。
溫控精度與均一性
溫度控制精度：± 0.1 ℃；
平板孔間溫差：≤ 0.3 ℃；
多點溫度傳感設(shè)計，實現(xiàn)對樣本架底板與蓋板同時監(jiān)控。
升降溫速率
標(biāo)稱最大升溫速率：4.5 ℃/s；
標(biāo)稱最大降溫速率：3.5 ℃/s；
支持用戶自定義斜率曲線，滿足特定擴增協(xié)議要求。
保溫與預(yù)冷功能
儀器待機時可設(shè)定低溫預(yù)冷（4 ℃）模式，適合冷鏈需求實驗；
自診斷功能每次開機執(zhí)行溫度校準(zhǔn)并自動記錄校準(zhǔn)報告。
多通道激發(fā)與檢測
激發(fā)光源：四色 LED（Blue, Green, Yellow, Red），覆蓋 450–660 nm 是別；
檢測通道：最多可設(shè)定 5 個熒光通道，兼容 FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5、Cy3 等常用染料；
動態(tài)濾光片切換時間：＜ 10 ms，保證快速的多重檢測執(zhí)行。
探測器性能
光電倍增管（PMT）檢測，信噪比可達 1:800；
自動背景扣除功能，可有效剔除板材及封板膜自發(fā)熒光。
定量范圍與線性度
定量檢測范圍：10^1–10^9 copies；
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸系數(shù)（R2）：≥ 0.995；
檢測限：可檢測到數(shù)拷貝水平的目標(biāo)序列。
界面布局與功能模塊
實驗設(shè)計向?qū)В豪孟驅(qū)浇缑嬷鸩皆O(shè)置擴增程序、熒光通道與樣本布局；
實時監(jiān)控面板：實時展示每孔擴增曲線及熔解曲線，支持多種縮放與對比分析；
模板管理：可儲存、導(dǎo)入、導(dǎo)出實驗?zāi)０澹涌熘貜?fù)實驗設(shè)置。
分析方法
定性分析：Ct（閾值循環(huán)數(shù)）判定、擴增曲線形態(tài)學(xué)檢查；
相對定量：ΔΔCt 法，支持多種內(nèi)參基因設(shè)定；
絕對定量：利用標(biāo)準(zhǔn)品梯度曲線自動計算樣本拷貝數(shù)；
熔解曲線分析：可對 PCR 產(chǎn)物進行熔解曲線圖譜比對，檢測特異性與引物二聚體；
多重分型：基于不同熒光通道同時分析 SNP 位點。
報告與導(dǎo)出
數(shù)據(jù)輸出格式：CSV、Excel、PDF、圖像（JPEG、PNG）；
自定義報告模板：支持添加實驗信息、曲線圖、統(tǒng)計表格與備注；
批量導(dǎo)出功能：可一次性導(dǎo)出多個實驗結(jié)果。
基因表達研究
在細(xì)胞學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及藥物篩選研究中，通過熒光標(biāo)記引物對目標(biāo)基因進行精準(zhǔn)定量；
可同時對多種轉(zhuǎn)錄本進行監(jiān)測，適合高通量篩選。
病原體檢測
在公共衛(wèi)生和臨床診斷中，快速檢測病毒（如流感病毒、冠狀病毒）、細(xì)菌（如結(jié)核分枝桿菌）、真菌 DNA；
短循環(huán)時間可實現(xiàn) 40 min 內(nèi)的初步定性結(jié)果。
轉(zhuǎn)基因作物與食品安全
檢測樣本中常見的轉(zhuǎn)基因片段（如 35S 啟動子、NOS 終止子）；
在食品安全監(jiān)管中，對潛在過敏原和污染物進行定量分析。
SNP 分型與拷貝數(shù)變異
使用熒光探針技術(shù)實現(xiàn)單堿基多態(tài)性位點的精確定性與分型；
拷貝數(shù)變異分析支持基因擴增或缺失檢測。
微生物群落定量
配合特定引物組，可針對環(huán)境樣本或腸道菌群進行定量分析；
應(yīng)用于生態(tài)學(xué)、疾病模型研究等領(lǐng)域。
開機與關(guān)機流程
開機前檢查電源與通信線連接；
關(guān)機時先關(guān)閉軟件，再按順序斷開電源。
試劑與耗材管理
建議選用低漂白或無漂白板材與封板膜，減少背景信號；
熒光探針、引物及酶體系應(yīng)儲存于 ?20 ℃，使用前室溫平衡。
日常清潔
每次運行結(jié)束后，用無塵布或?qū)I(yè)鏡頭紙輕拭光學(xué)窗口；
樣本架底板可定期用 70% 乙醇擦拭，防止樣本交叉污染。
定期校準(zhǔn)
溫度校準(zhǔn)：至少每 6 個月進行一次，可通過校準(zhǔn)板或標(biāo)準(zhǔn)試劑驗證；
光學(xué)校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)熒光染料或校準(zhǔn)板檢測各通道靈敏度。
故障排查
軟件異常：重啟軟件或主機，檢查日志文件；
硬件報警：參考錯誤代碼手冊，必要時聯(lián)系技術(shù)支持。
外觀檢查
機箱是否平整，無明顯劃痕或凹陷；
樣本架及蓋板運動是否順暢，無卡滯。
功能驗證
溫度響應(yīng)測試：運行經(jīng)典梯度 PCR 程序，記錄升降溫速率與均一性；
熒光檢測測試：采用標(biāo)準(zhǔn)熒光板和陰性對照，檢測信號線性度與背景水平；
軟件操作：創(chuàng)建新實驗、加載模板、執(zhí)行擴增、生成并導(dǎo)出報告。
配件完整性
樣本架、光學(xué)封板膜、電源線、通信線及軟件安裝盤或軟件授權(quán)文件是否齊全；
校準(zhǔn)報告、使用手冊及售后合同是否隨同交付。
高校分子生物學(xué)實驗室
某大學(xué)生命科學(xué)中心購入 LightCycler 96，用于腫瘤轉(zhuǎn)錄組差異表達研究，月均運行 100 板次，結(jié)果重現(xiàn)性優(yōu)良；
第三方食品檢測機構(gòu)
采用本儀器開展轉(zhuǎn)基因成分定量分析，支持 ISO17025 及 GMP 質(zhì)量管理體系審核；
區(qū)域疾病控制中心
在流感季節(jié)，將其用于呼吸道病原體核酸檢測，實現(xiàn)日均 500 例樣本篩查。
質(zhì)保條款
核心部件（溫控模塊、光學(xué)模塊）質(zhì)保期 6 個月；
其他易損件（封板膜、密封圈）質(zhì)保期 3 個月。
技術(shù)培訓(xùn)
提供儀器安裝與使用培訓(xùn)，包含軟件操作與常見問題處理；
可根據(jù)需求安排上門培訓(xùn)。
遠(yuǎn)程與現(xiàn)場支持
遠(yuǎn)程診斷：通過專用軟件監(jiān)控運行狀態(tài)并分析日志；
現(xiàn)場服務(wù)：簽署服務(wù)協(xié)議后，在 48 小時內(nèi)派遣工程師（限國內(nèi)主要城市）。
配件與升級
擴展模塊
梯度模塊：可選裝的梯度溫區(qū)附件，可實現(xiàn)不同溫度條件的平行擴增，適合引物退火溫度篩選；
多孔板適配器：支持 384 孔板和 72 條管格式，滿足超高通量需求。
軟件選配
數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)（LIMS）接口：可將實驗數(shù)據(jù)自動上傳至實驗室信息管理系統(tǒng)；
高級統(tǒng)計插件：包含聚類分析、主成分分析（PCA）等功能，用于大規(guī)模數(shù)據(jù)挖掘。
耗材與試劑
低漂白微孔板：推薦采用無漂白或低漂白板材，減少背景熒光；
光學(xué)封板膜：優(yōu)選超低自發(fā)熒光專用膜，保證檢測靈敏度；
熒光探針體系：羅氏探針試劑盒及多家兼容品牌試劑均可配合使用，用戶可根據(jù)預(yù)算和實驗要求選擇。
選購建議
實驗規(guī)模：常規(guī)實驗室建議標(biāo)配 96 孔板，若短期內(nèi)有大量樣本，可考慮同時采購梯度與多孔板適配器；
經(jīng)費預(yù)算：二手設(shè)備與全新設(shè)備在初期投入上相差顯著，結(jié)合實驗室總體預(yù)算與項目周期做綜合決策；
售后服務(wù)：確認(rèn)供應(yīng)商提供的軟件授權(quán)、質(zhì)保期與工程師響應(yīng)時間；
數(shù)字 PCR（dPCR）預(yù)實驗
雖然 LightCycler 96 非數(shù)字 PCR 儀，但可用作高靈敏度預(yù)實驗平臺，對樣本進行初步擴增與 Ct 值篩選，為后續(xù)數(shù)字 PCR 定量提供參考；
多重 PCR 優(yōu)化
通過調(diào)整熒光通道及引物濃度，實現(xiàn)對 3–4 個目標(biāo)序列的同時檢測；
借助梯度模塊優(yōu)化不同引物對的退火溫度，減少非特異擴增；
甲基化特異 PCR
配合甲基化敏感探針，進行基因組 DNA 甲基化水平定量；
可在常規(guī) qPCR 基礎(chǔ)上，通過設(shè)計特異性引物實現(xiàn)甲基化與未甲基化序列區(qū)分；
miRNA 表達譜分析
利用干擾性引物和熒光探針體系，對短小 RNA 片段進行擴增與定量；
需要在反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)加入特定的適配器序列；
| 問題描述 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| Ct 值波動大，重復(fù)性差 | 樣本上機前溫度不均一；試劑配制不準(zhǔn)確；板材質(zhì)量低 | 樣本及試劑室溫平衡；使用多通道移液器；選用低漂白板與封板膜。 |
| 擴增曲線形狀異常（平緩或遲滯） | 引物設(shè)計問題；模板純度不夠；熒光探針失效 | 重新設(shè)計引物并做梯度退火溫度預(yù)測；純化模板或稀釋檢測；更換熒光探針。 |
| 熔解曲線出現(xiàn)多峰 | 非特異擴增或引物二聚體 | 檢查熔解曲線溫度范圍；優(yōu)化引物濃度與退火溫度；在擴增體系中加入 DMSO 或甘油。 |
| 光學(xué)報警，無法讀取熒光信號 | 板材與膜貼合不嚴(yán)或位置偏移；光學(xué)窗口臟污 | 重新貼膜并校正樣本架位置；用無塵紙或鏡頭紙清潔光學(xué)窗口。 |
| 軟件崩潰或報錯 | 軟件版本與操作系統(tǒng)不兼容；用戶文件損壞 | 升級至最新授權(quán)版本；備份并重新導(dǎo)入實驗?zāi)０?；?lián)系技術(shù)支持獲取安裝包及補丁。 |
| 溫度不達標(biāo)或溫差超標(biāo) | 溫控模塊老化；散熱風(fēng)扇故障 | 進行溫控模塊校準(zhǔn)或更換；檢查風(fēng)扇及散熱通道是否被堵塞，必要時清理或更換風(fēng)扇。 |
| 參數(shù)類型 | 指標(biāo) |
|---|---|
| 孔板通量 | 96 孔/板，支持兼容 384 孔與條管格式 |
| 溫度控制精度 | ±0.1 ℃ |
| 溫度均勻性 | ≤ 0.3 ℃ |
| 最大升溫速率 | 4.5 ℃/s |
| 最大降溫速率 | 3.5 ℃/s |
| 激發(fā)光源 | RGBY 四色 LED |
| 檢測通道 | 最多 5 通道（可選） |
| 熒光染料兼容性 | FAM, HEX/VIC, ROX, Cy5, Cy3 等 |
| 靈敏度 | 單拷貝級別 |
| 線性范圍 | 101–10? copies |
| 線性回歸系數(shù) (R2) | ≥ 0.995 |
| 觸摸屏尺寸 | 7 英寸 |
| 軟件輸出格式 | CSV, Excel, PDF, JPEG, PNG |
| 通訊接口 | USB 2.0 ×2, LAN ×1 |
| 電源要求 | AC 100–240 V, 50/60 Hz |
| 工作環(huán)境溫度 | 15–30 ℃ |
| 相對濕度 | 20–80%（無冷凝） |
| 關(guān)機功耗 | ＜ 5 W |
以上內(nèi)容涵蓋了 LightCycler 96 的設(shè)計結(jié)構(gòu)、性能指標(biāo)、檢測系統(tǒng)、軟件平臺、應(yīng)用領(lǐng)域、操作維護、配件選購、進階應(yīng)用、常見問題及技術(shù)參數(shù)，幫助用戶全面了解該儀器的功能特點及使用要點。
當(dāng)前位置：
